氨基亲体有什么作用?
氨基亲合色谱法(Amino Group Affinity Chromatography,简写为AGAC)是利用蛋白质和肽的氨基酸序列与含氨基酸的聚合物之间独特的氨基酸序列特异性结合的特点而进行的分离分析方法。其基本原理是将带有活性氨基的固相载体通过键合到柱上,形成携带正电荷的固相基质。由于大多数天然蛋白都具有阳离子表面带电的性质,所以带正电的固相基质可与天然蛋白或肽链上的游离氨基酸以静电引力吸附到氨基亲合色谱柱上,然后根据不同的氨基酸序列进行分离。 由于合成多肽及蛋白质中氨基酸的排列顺序对其生物学功能有重要的影响,了解多肽和蛋白质的氨基酸序列对于研究分子生物学、药物设计等领域有着重要意义。近年来,随着基因测序技术的不断发展,从基因组水平获得氨基酸序列已成为可能,而应用最广泛的氨基酸序列分析技术就是膜片钳记录。这种方法可同时检测大量样品中的多种序列类型,具有灵敏度高、特异性强等特点。但由于实验成本较高,该方法在临床化学检验方面的应用受到一定限制。
目前,常用的氨基酸序列分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)、串联质谱法(TSP)等。 HPLC利用的是不同氨基酸之间的色谱峰强度差异进行分离鉴定。虽然该方法原理简单,但实现起来较为复杂。首先,待测样品要经过肽段释放处理,将蛋白样品转化为具有一定氨基酸序列的多肽片段再进行色谱分离;其次,为了提高检测的灵敏度,常采用酶解法对氨基酸进行衍生化处理后再进行HPLC测定。利用HPLC还可以对含有相同氨基酸序列的不同分子量蛋白组分进行定量分析。不过,HPLC只能区分混合物中两种氨基酸序列的差异,无法检测单一种类氨基酸序列的多寡。
MS可直接分析混合物中各类别氨基酸的含量,无需先对其进行分离提纯。但由于蛋白质在酶解过程中会产生多肽,进而引起峰形扩散,给定性分析带来困难。还受试剂、仪器条件等因素的影响较大,因而缺乏统一的标准溶液,难以准确测量含量,导致结果的重现性较差。另外,该方法也无法对单个氨基酸序列进行确定。 TSP是在MS的基础上发展起来的新型氨基酸序列分析技术。它克服了前者的诸多不足之处,能够同时对多个样品进行分析并给出精确的定量结果,而且具有快速、简便、敏感性高等优点。